导语：为什么胰岛素明明“努力工作”，肌肉却还是“拒收”葡萄糖?这个困扰学界的谜题，或许藏在GLUT4转运的“偏心”里。这项研究揭开了胰岛素抵抗的选择性秘密，为精准改善肌肉葡萄糖摄取、破解代谢疾病困局提供了全新视角。

        GLUT4转运评估依赖过表达模型，

        难反映生理状态，

        精准检测endogenous GLUT4是关键

        骨骼肌中胰岛素刺激的GLUT4转运对全身葡萄糖稳态至关重要，其功能异常是胰岛素抵抗及代谢疾病的核心机制。目前评估GLUT4转运的方法存在明显局限：要么依赖过表达带标签的GLUT4构建体，可能导致蛋白定位异常且无法反映内源性蛋白的真实状态;要么采用间接测量手段，生理相关性不足。

        虽然肌肉细胞系(如L6、C2C12)常被用于研究，但它们分化不成熟，GLUT4表达量低，胰岛素敏感性远不及成熟肌肉组织。近年来，针对内源性GLUT4胞外表位的抗体研发取得进展，为直接检测其转运提供了可能，但尚未在骨骼肌中验证应用。2025年7月，Diabetes杂志发表了一篇题为“Analysis of Multiple Insulin Actions in Single Muscle Fibers From Insulin-Resistant Mice Reveals Selective Defect in Endogenous GLUT4 Translocation”的文章，该研究开发了一种高灵敏度成像方法，可直接评估原代肌纤维中内源性GLUT4的转运，并同步分析其他胰岛素敏感过程，为解析肌肉胰岛素抵抗的选择性缺陷提供了全新工具。

        基于特异性抗体开发成像方法，

        同步评估GLUT4转运与其他胰岛素敏感过程，

        跨模型验证

        本研究是一项结合细胞生物学与成像技术，旨在建立直接检测内源性GLUT4转运的方法，并探究胰岛素抵抗状态下肌肉细胞中多种胰岛素作用变化的基础研究。

        研究选用15-20周龄的C57BL/6J、BXH9/TyJ等多种近交系小鼠，以及GLUT4敲除和敲低模型小鼠。分离趾短屈肌(FDB)的成熟肌纤维进行原代培养，采用识别内源性GLUT4胞外表位的LM048和LM052抗体，通过共聚焦显微镜检测细胞膜上GLUT4的丰度(反映转运能力)。

        实验分组包括：基础状态与胰岛素刺激(1-100nmol/L)组，棕榈酸(10-100μmol/L)或慢性胰岛素(10nmol/L)处理的胰岛素抵抗模型组，以及高脂饮食(HFD)喂养6周的肥胖模型组。主要评价指标为胰岛素刺激的内源性GLUT4膜转运效率，次要指标包括转铁蛋白受体(TfR)转运、FOXO核排斥及线粒体活性氧(mitoROS)水平，以评估其他胰岛素敏感通路的功能。

        内源性GLUT4转运可被精准检测，

        胰岛素抵抗时其选择性受损，

        其他通路保持完整

        研究首先验证了内源性GLUT4检测方法的可靠性。原代肌纤维中，GLUT4主要分布于核周区域及胞质囊泡，GLUT4敲低小鼠的GLUT4含量减少74.3%，证实抗体特异性(图1B、C)。双标实验显示，GLUT4阳性囊泡可分为转铁蛋白受体(TfR)阳性和阴性两类，与已知的GLUT4 compartmentalization特征一致(图1D、E)。胰岛素(100nmol/L)刺激后，LM048和LM052抗体检测到膜上GLUT4分别增加3倍和1.8倍，其中LM048因亲和力更高(1.0E-12 vs. 1.8E-9 mol/L)表现更稳定(图1F、G)。

        A：肌纤维分离及胰岛素敏感性和线粒体参数评估的实验流程。

        B：野生型或GLUT4敲低(KD)小鼠趾短屈肌(FDB)分离的肌纤维中，细胞内GLUT4和细胞核的共聚焦显微镜图像。右上角为用于计算GLUT4密度的二元阈值，右下角标注野生型肌纤维的核周区域(仅野生型标注)。

        C：不同基因型肌纤维中GLUT4密度的定量分析(基于GLUT4信号的二元化处理)。每个数据点代表单个肌纤维，实线为中位数，虚线为平均值，误差线为1.5倍四分位距(Tukey箱线图)。****P<0.0001。

        D：野生型分离肌纤维的共聚焦显微镜图像，GLUT4(绿色)和转铁蛋白受体(TfR)双标，显示为100.5μm的Z轴投影。细胞核以蓝色标注，黄色表示GLUT4与TfR的共定位。特写面板显示细胞质和核周区域的大型GLUT4储存库。

        E：野生型肌纤维中GLUT4与TfR双标实验的Mander系数(M1和M2)定量分析。平均值±标准误(n=4个生物学重复)。

        F：使用GLUT4胞外抗体LM048和LM052，对基础状态和胰岛素(100nmol/L)刺激的未透化肌纤维中细胞膜GLUT4(pmGLUT4)染色的定量分析。数据为背景校正后的荧光强度，每个数据点代表单个肌纤维，按生物学重复着色。误差线为1.5倍四分位距(Tukey箱线图)，LM048的n=3个生物学重复(每个生物学重复的技术重复已标注)，LM052的本实验n=1个技术重复。A.U.，任意单位。****P<0.0001。

        G：每种抗体的细胞膜GLUT4(pmGLUT4)相对于基础状态肌纤维的荧光强度倍数增加定量分析。平均值±标准误(n=3个生物学重复)。****P<0.0001。

图1——分离的小鼠肌纤维中GLUT4含量丰富且定位正常，并呈现胰岛素依赖性的细胞膜转运

        胰岛素剂量反应实验显示，GLUT4转运呈剂量依赖性，半最大效应浓度(EC50)为0.65nmol/L，10nmol/L时达最大值，信号主要局限于肌膜(图2A-C)。该方法在C57BL/6、BXH9等4种近交系小鼠中均有效，胰岛素刺激后膜上GLUT4均增加约3倍(图2F)。GLUT4敲除小鼠中无信号，进一步证实特异性(图2D、E)。

        A：用LM048染色的不同胰岛素浓度下，细胞膜GLUT4(pmGLUT4)相对于基础状态(0nmol/L)的定量分析。数据点代表单个肌纤维，按生物学重复着色。虚线为平均值，误差线为1.5倍四分位距(Tukey箱线图)(n=2个生物学重复，每个生物学重复的技术重复已标注)。通过三参数希尔方程计算的半最大效应浓度(EC₅₀)已标注。

        B：基础状态及胰岛素(1nmol/L和100nmol/L)处理的分离肌纤维经LM048和Hoechst(红色)染色的代表性共聚焦显微镜图像。左上角标注整个肌纤维区域。

        C：经GLUT4和细胞核染色的分离肌纤维的正交视图(同B)。Z轴堆叠间隔为0.5mm。

        D：用10nmol/L胰岛素处理并经LM048染色或无一抗(No 1Ab)的野生型或GLUT4敲除(KO)小鼠肌纤维中，细胞膜GLUT4(pmGLUT4)的定量分析。无一抗组为野生型肌纤维。平均值±标准误(n=3个生物学重复)。***P<0.001，****P<0.0001;ns，无显著性差异。

        E：与D中条件对应的分离肌纤维代表性共聚焦显微镜图像。整个肌纤维通过autofluorescence确定(上排)，细胞膜GLUT4(pmGLUT4)以灰色显示(下排)。

        F：四种近交系小鼠肌纤维中细胞膜GLUT4(pmGLUT4)的定量分析。数据表示为相对于各品系基础状态平均值的背景校正荧光强度倍数增加。平均值±标准误(n=3-6个生物学重复)。****P<0.0001。

        G：从C57BL/6小鼠分离的肌纤维在对照条件或16小时棕榈酸(palm)或慢性胰岛素(CI)刺激下，细胞膜GLUT4(pmGLUT4)的定量分析。数据点表示为相对于对照基础状态平均值的背景校正荧光强度倍数增加。标注了相对于对照胰岛素组的百分比变化及显著性星号。平均值±标准误(n=3个生物学重复)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

        H：G中所示处理条件下C57BL/6肌纤维中的线粒体活性氧(mitoROS)水平。平均值±标准误(n=3个生物学重复)。*P<0.05，***P<0.001。

图2——使用GLUT4胞外抗体LM048检测到分离的肌纤维中GLUT4转运具有显著的剂量依赖性

        胰岛素抵抗模型中，GLUT4转运存在选择性缺陷。慢性胰岛素(10nmol/L，16h)处理使转运降低30.9%;棕榈酸以剂量依赖方式抑制转运，10μmol/L和100μmol/L分别降低22.7%和41.9%，同时线粒体活性氧(mitoROS)增加2-3.2倍(图2G、H)。高脂饮食(HFD)6周的C57BL/6和BXH9小鼠，膜上GLUT4分别减少90%和54%，mitoROS增加40-50%，且原代培养后缺陷仍存在(图3G、I)。

        A：C57BL/6和BXH9小鼠在6周普通饮食或高脂饮食(HFD)方案中的体重变化。平均值±标准差(n=6-7个生物学重复)。***P<0.001，****P<0.0001。

        B：C57BL/6和BXH9小鼠的肥胖率(脂肪率)。平均值±标准差(n=6-7个生物学重复)。*P<0.05，****P<0.0001。

        C、E：口服葡萄糖耐量试验(oGTT)期间的血糖浓度。平均值±标准差(n=6-7个生物学重复)。左下角标注饮食间增量曲线下面积(iAUC)的统计学显著性。

        D、F：C和E中oGTT的0分钟和15分钟血糖胰岛素水平(个体小鼠数据)。黑色水平线表示组平均值。*P<0.05，**P<0.01。

        G：从接受指定饮食干预的C57BL/6和BXH9小鼠分离的肌纤维中，细胞膜GLUT4(pmGLUT4)的定量分析。数据表示为相对于各品系普通饮食基础状态平均值的背景校正荧光强度倍数增加。平均值±标准误(n=3-6个生物学重复)。**P<0.01，****P<0.0001。

        H：从接受指定饮食干预并经10nmol/L胰岛素处理的C57BL/6和BXH9小鼠分离的肌纤维代表性共聚焦显微镜图像。

        I：从接受饮食干预的C57BL/6和BXH9小鼠分离的肌纤维中的线粒体活性氧(mitoROS)水平。数据表示为相对于各品系普通饮食平均值的背景校正荧光强度倍数增加。平均值±标准误(n=3-6个生物学重复)。**P<0.01。

图3——分离的肌纤维中保留了肌肉胰岛素抵抗表型

        其他胰岛素敏感过程在抵抗状态下保持正常。胰岛素刺激使TfR膜转运增加1.5倍，HFD组与正常组无差异(图4A、F);FOXO核排斥率达45%，AKT抑制剂MK2206可阻断该效应，HFD组排斥率未降低(图4D、G)。

        A：基础状态和胰岛素(100nmol/L)刺激的未透化C57BL/6分离肌纤维中，细胞膜转铁蛋白受体(pmTfR)染色的定量分析(使用转铁蛋白受体胞外表位抗体)。数据表示为相对于基础状态平均值的背景校正荧光强度倍数增加。平均值±标准误(n=3个生物学重复)。*P<0.05。

        B：分离肌纤维中，基础状态与最大胰岛素刺激(100nmol/L)之间细胞膜转铁蛋白受体(pmTfR)和细胞膜GLUT4(pmGLUT4)的相对变化。数据表示为最大胰岛素刺激状态的比例。平均值±标准差(n=3个生物学重复)。

        C：基础状态和胰岛素(100nmol/L)处理的分离肌纤维代表性共聚焦显微镜图像。图像代表转铁蛋白受体的平均强度(黄色)，同时显示GLUT4的响应及细胞核。

        D：C57BL/6分离肌纤维中核内FOXO的定量分析，数据表示为相对于基础状态平均值的背景校正荧光强度倍数增加。平均值±标准误(n=3个生物学重复)。**P<0.01。

        E：与D中条件对应的分离肌纤维代表性共聚焦显微镜图像。上排仅显示FOXO染色，下排同时显示FOXO和细胞核(红色)染色。面板额外标注核区域。

        F：从接受指定饮食干预的C57BL/6小鼠分离的肌纤维中，细胞膜转铁蛋白受体(pmTfR)的定量分析。D和F：实验使用图3G中的部分小鼠，其中高脂饮食组胰岛素诱导的GLUT4转运减少>90%。数据表示为相对于普通饮食基础状态平均值的背景校正荧光强度倍数增加。平均值±标准误(n=3个生物学重复)。*P<0.05;ns，无显著性差异。

        G：从接受指定饮食干预的C57BL/6小鼠分离的肌纤维中，核内FOXO的定量分析。数据表示为相对于普通饮食基础状态平均值的背景校正荧光强度倍数变化。平均值±标准误(n=3个生物学重复)。*P<0.05，**P<0.01;ns，无显著性差异。

        H：示意图展示具有胰岛素抵抗的肌纤维，其特征为GLUT4转运的选择性缺陷。该缺陷与线粒体活性氧(mitoROS)相关，但其潜在机制尚不清楚(以虚线表示)。RE，再循环内体。

图4——骨骼肌胰岛素抵抗具有GLUT4选择性

        总结

        本研究的核心价值在于建立了首个直接检测成熟肌纤维中内源性GLUT4转运的方法，克服了传统依赖过表达模型的局限，更贴近生理状态。通过该方法首次明确，胰岛素抵抗时肌肉细胞中存在“选择性缺陷”——仅GLUT4转运受损，而TfR转运、FOXO核排斥等其他胰岛素通路保持正常。

        这一发现为理解胰岛素抵抗的分子机制提供了新视角，提示针对GLUT4转运的靶向干预可能更有效改善肌肉葡萄糖摄取。同时，该方法可同步评估多种胰岛素作用及线粒体功能，为筛选改善GLUT4转运的药物、探究基因-环境交互作用对代谢疾病的影响提供了强大工具，推动肌肉胰岛素抵抗研究向更精准的方向发展。

        参考资料

        Judge S, Masson S W C, Madsen S, et al. Analysis of Multiple Insulin Actions in Single Muscle Fibers From Insulin-Resistant Mice Reveals Selective Defect in Endogenous GLUT4 Translocation[J]. Diabetes, 2025, 74(7): 1121-1134.

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